Nano ölçekli biyolojik yapıların görüntülenmesi için kullanılan süper çözünürlüklü mikroskop sistemlerinin yüksek maliyeti, birçok araştırma laboratuvarı için erişilebilirliği sınırlamaktadır. Bu bağlamda, mevcut mikroskop sistemlerine entegre edilebilen ve maliyet etkinliği yüksek olan bir genişletme tekniği sayesinde, hücre içi nano yapıların karakterizasyonu için yeni bir yaklaşım sunulmuştur.
Hücre içi nano yapıların karakterizasyonunda yaygın olarak kullanılan süper çözünürlüklü mikroskop sistemleri, yüksek maliyetleri ve karmaşık yapıları nedeniyle birçok araştırma laboratuvarı için erişilebilir değildir. Bu durum, hücre biyolojisi alanındaki çalışmaları sınırlamaktadır. MIT'de geliştirilen yeni bir görüntüleme yaklaşımı, bu soruna alternatif bir çözüm sunmaktadır. Bu yaklaşımda, doku örnekleri görüntüleme öncesinde genişletilerek, geleneksel ışık mikroskopları ile bile nano ölçekli çözünürlük elde edilmesi sağlanmaktadır.
Bu tekniğin en yeni versiyonunda, araştırmacılar dokuyu tek bir adımda 20 kat genişletmeyi mümkün kıldılar. Bu basit, ucuz yöntem, hemen hemen her biyoloji laboratuvarının nano ölçekli görüntüleme yapmasının önünü açabilir.
MIT'de Novartis Kimya Profesörü ve MIT ve Harvard Broad Enstitüsü ile MIT'nin Koch Bütünleşik Kanser Araştırmaları Enstitüsü üyesi Laura Kiessling, "Bu görüntülemeyi demokratikleştiriyor" diyor. "Bu yöntem olmadan, şeyleri yüksek çözünürlükte görmek istiyorsanız, çok pahalı mikroskoplar kullanmanız gerekir. Bu yeni teknik, normalde standart mikroskoplarla göremeyeceğiniz şeyleri görmenizi sağlar. Özel bir tesise ihtiyaç duymadan nanometre ölçeğindeki şeyleri görebildiğiniz için görüntüleme maliyetini düşürür.”
Bu teknikle elde edilen çözünürlükte, yani yaklaşık 20 nanometrede, bilim insanları hücrelerin içindeki organelleri ve protein kümelerini görebilirler.
“Yirmi kat genişleme sizi biyolojik moleküllerin faaliyet gösterdiği alana götürür. Yaşamın yapı taşları nanometre ölçeğindeki şeylerdir: biyomoleküller, genler ve gen ürünleri,” diyor MIT'de Nöroteknoloji alanında Y. Eva Tan Profesörü; biyolojik mühendislik, medya sanatları ve bilimleri ve beyin ve bilişsel bilimler profesörü; Howard Hughes Tıp Enstitüsü araştırmacısı; ve MIT'nin McGovern Beyin Araştırmaları Enstitüsü ve Koch Bütünleşik Kanser Araştırmaları Enstitüsü üyesi Edward Boyden.
Boyden ve Kiessling, bugün Nature Methods'da yayınlanan yeni çalışmanın kıdemli yazarlarıdır. Makalenin baş yazarları MIT lisansüstü öğrencisi Shiwei Wang ve Tay Won Shin’dir.
Boyden'ın laboratuvarı, genişleme mikroskobisini 2015 yılında icat etti. Bu teknik, dokuyu emici bir polimere gömmeyi ve dokuyu normalde bir arada tutan proteinleri parçalamayı gerektirir. Su eklendiğinde, jel şişer ve biyomolekülleri birbirinden ayırır.
Dokuyu yaklaşık dört kat genişleten bu tekniğin orijinal versiyonu, araştırmacıların yaklaşık 70 nanometre çözünürlüklü görüntüler elde etmesini sağladı. Boyden'ın laboratuvarı, 2017'de süreci ikinci bir genişleme adımı içerecek şekilde değiştirdi ve genel olarak 20 kat genişleme elde etti. Bu, daha da yüksek bir çözünürlük sağlıyor, ancak süreç daha karmaşık.
Boyden, "Geçmişte birkaç 20 kat genişleme teknolojisi geliştirdik, ancak bunlar birden fazla genişleme adımı gerektiriyor," dedi ve devamında, "Bu miktarda genişlemeyi tek bir adımda yapabilirseniz, bu işleri oldukça basitleştirebilir." diye ekledi.
20 kat genişlemeyle, araştırmacılar geleneksel bir ışık mikroskobu kullanarak yaklaşık 20 nanometre çözünürlüğe inebilirler. Bu, mikrotübüller ve mitokondriler gibi hücre yapılarını ve protein kümelerini görmelerini sağlar.
Yeni çalışmada, araştırmacılar yalnızca tek bir adımda 20 kat genişleme gerçekleştirmeye koyuldular. Bu, 20 kat genişlediğinde parçalanmayacak şekilde hem son derece emici hem de mekanik olarak kararlı bir jel bulmaları gerektiği anlamına geliyordu.
Bunu başarmak için, N,N-dimetilakrilamid (DMAA) ve sodyum akrilattan oluşan bir jel kullandılar. Polimer iplikçikleri arasında çapraz bağlar oluşturmak için başka bir molekül eklemeye dayanan önceki genişleme jellerinin aksine, bu jel kendiliğinden çapraz bağlar oluşturur ve güçlü mekanik özellikler sergiler. Bu tür jel bileşenleri daha önce genişleme mikroskopisi protokollerinde kullanılmıştı, ancak ortaya çıkan jeller yalnızca yaklaşık on kat genişleyebiliyordu. MIT ekibi, jeli ve polimerizasyon sürecini, jeli daha sağlam hale getirmek ve 20 kat genişlemeye izin vermek için optimize etti.
Jeli daha da stabilize etmek ve tekrarlanabilirliğini artırmak için araştırmacılar, çapraz bağlamaya müdahale eden yan reaksiyonları önleyen jelleşmeden önce polimer çözeltisinden oksijeni çıkardılar. Bu adım, sistemdeki oksijenin çoğunu değiştiren polimer çözeltisinden azot gazı geçirmeyi gerektirir.
Jel oluştuktan sonra, dokuyu bir arada tutan proteinlerdeki seçili bağlar koparılır ve jelin genişlemesini sağlamak için su eklenir. Genişleme gerçekleştirildikten sonra, dokudaki hedef proteinler etiketlenebilir ve görüntülenebilir.
Shin, "Bu yaklaşım, diğer süper çözünürlüklü tekniklere kıyasla daha fazla numune hazırlama gerektirebilir, ancak özellikle 3B görüntüleme için gerçek görüntüleme sürecine gelince çok daha basittir," dedi ve devamında, "Okuyucuların kolayca inceleyebilmesi için adım adım protokolü el yazmasında belgelendiriyoruz." diye ekledi.
Küçük Yapıların Görüntülenmesi
Araştırmacılar bu tekniği kullanarak beyin hücreleri içindeki sinaptik nanokolonlar adı verilen yapılar da dahil olmak üzere birçok küçük yapıyı görüntüleyebildiler. Bunlar nöronal sinapslarda belirli bir şekilde düzenlenmiş protein kümeleridir ve nöronların dopamin gibi nörotransmitterlerin salgılanması yoluyla birbirleriyle iletişim kurmasını sağlar.
Kanser hücreleri üzerinde yapılan çalışmalarda araştırmacılar ayrıca mikrotübülleri de görüntülediler - hücrelere yapılarını veren ve hücre bölünmesinde önemli roller oynayan içi boş tüpler. Ayrıca mitokondrileri (enerji üreten organeller) ve hatta bireysel nükleer gözenek komplekslerinin (hücre çekirdeğine erişimi kontrol eden protein kümeleri) organizasyonunu da görebildiler.
Wang şimdi bu tekniği hücre yüzeylerinde bulunan ve hücrelerin çevreleriyle etkileşimlerini kontrol etmeye yardımcı olan glikan olarak bilinen karbonhidratları görüntülemek için kullanıyor. Bu yöntem tümör hücrelerini görüntülemek için de kullanılabilir ve bilim insanlarının proteinlerin bu hücreler içinde nasıl organize edildiğini daha önce mümkün olandan çok daha kolay bir şekilde görmelerini sağlayabilir.
Araştırmacılar, herhangi bir biyoloji laboratuvarının bu tekniği düşük bir maliyetle kullanabilmesini öngörüyor çünkü bu teknik, çoğu laboratuvarın zaten sahip olduğu veya kolayca erişebildiği konfokal mikroskoplar ve eldiven çantaları gibi standart, hazır kimyasallara ve yaygın ekipmanlara dayanıyor.
Wang, "Umuyoruz ki bu yeni teknolojiyle, herhangi bir geleneksel biyoloji laboratuvarı bu protokolü mevcut mikroskoplarıyla kullanabilir ve bu sayede yalnızca çok özel ve maliyetli son teknoloji mikroskoplarla elde edilebilecek çözünürlüğe yaklaşabilirler" dedi.
Araştırma, kısmen ABD Ulusal Sağlık Enstitüleri, MIT Başkanlık Lisansüstü Bursu, ABD Ulusal Bilim Vakfı Lisansüstü Araştırma Bursu hibeleri, Açık Hayırseverlik, Good Ventures, Howard Hughes Tıp Enstitüsü, Lisa Yang, Ashar Aziz ve Avrupa Araştırma Konseyi tarafından finanse edildi.
by MIT News
Comments